martes, 9 de octubre de 2012

Coliformes. Qué son? Que representan? Reflejan realmente contaminación fecal?

Por: Bernardo Mejía Arango M.V.Z.  M.Sc.
Fotografías e imágenes: Bernardo Mejía Arango  M.V.Z.  M.Sc. Protegidas por derechos de autor. Cualquier uso o reproducción debe tener autorización preliminar

Premisa:  "No es completamente cierto que los aislamientos de coliformes reportados  en los análisis microbiológicos como de origen fecal, realmente los sean"

Determinar la presencia o ausencia de  bacterias coliformes se ha aplicado tradicionalmente a las diferentes  fases de procesamiento  y producción de alimentos, preferencialmente para la especie humana; se hace también dentro de los programans de buenas prácticas de producción de alimentos para animales al igual que para el control sanitario en la cadena de producción de alimentos a partir de la industria avícola.

En la medicina veterinaria avícola,  en la  evaluación de la calidad sanitaria tanto del agua como de los alimentos destinados para el suministro a las aves, se emplean las mismas técnicas que las que se usan exclusivamente para alimentos. La razón principal es que, además de otros géneros, dentro del grupo de las bacterias coliformes, se encuentra la Escherichia coli,  una de las más frecuentes, tal vez la más frecuente de las bacterias que causa estragos en las poblaciones avícolas.

El grupo de las bacterias coliformes  se denomina así, porque tienen forma de coli, refiriéndose a la principal bacteria del grupo, la Escherichia coli.

Imagen No. 1  Cultivo de Escherichia coli en medio MacConkey (Izquierda), en medio Eosina Azul de Metileno EMB (Centro).  Derecha: tinción de Gram de un extendido de uno de los cultivos de Escherichia coli.

El grupo de las bacterias coliformes tiene las siguientes características:
  • Son bacilos Gram negativos
  • No esporulados
  • Aerobios o anaerobios
  • Fermentan la lactosa con producción de ácido y gas
  • Algunos pueden ser fermentadores tardíos o no fermentadores (Citrobacter, Serratia)
  • Son oxidasa negativas
 La importancia de la determinación de coliformes, es que son indicadores de la contaminación de agua y alimentos.

Imagen No. 2   Salvado de trigo (Izquierda),  torta de soya (Centro), alimento terminado para granjas avícolas (Derecha). El control microbiológico de los alimentos para aves es  importante  no solo porque refleja la calidad sanitaria de los mismos, sino porque  se pueden detectar microorganismos perjudiciales para la salud de las aves, quienes eventualmente pueden convertirse en transmisores de agentes patógenos a  los humanos.
La mayoría de los coliformes pueden encontrarse en la flora normal del tracto digestivo del hombre o de los animales, por lo cual  estas bacterias son expulsadas por las heces.

Por tal motivo, suele deducirse que la mayoría de los coliformes  que se encuentran en el medio ambiente son de orgien fecal, y que  los coliformes es el grupo más ampliamente utilizado en la microbiología de alimentos como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas.

Esto no es completamente cierto porque los coliformes están ampliamente distribuidos en la naturaleza, especialmente en los suelos. Cuál entonces sería la metodología para determinar si los coliformes aislados de un  alimento están presentes en determinado alimento porque provienen de contaminación con materia fecal o porque vienen de otros componente del medio ambiente como por ejemplo del suelo? Hay forma de comprobar  que los coliformes aislados de un alimento, estríctamente proceden de la materia fecal de  alguien quien manipuló el alimento?

Imagen No. 3   El tratamiento de aguas reduce las cargas bacteriales lo cual no garantiza que las aguas empleadas en las granjas que tienen planta de tratamiento, estén completamente libres de bacterias. Las muestras para determinar la calidad bacteriológica del agua deben tomarse en puntos estratégicos de la granja, tanto porque es importante saber la calidad de la misma que llega finalmente a las aves, como porque se pueden establecer puntos críticos de control.

No obstante, tradicionalmente se han considerado como indicadores de contaminación fecal en el control de calidad de agua. Por tanto  su ausencia indica que el agua es bacterilógicamente segura. Los expertos en el tema aseguran que  su número en  las muestras de agua  es "proporcional al grado de contaminación fecal?"  y que  "Entre más  coliformes se aislan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de  heces" En mi experiencia personal, cada que reviso un caso en el cual se reportan coliformes fecales, mi pregunta es: cómo se sabe que estrictamente el aislamiento es por contaminación fecal?  Hay forma de probarlo? Las bacterias han podido llegar allí desde otra fuente.


Imagen No. 4.  Las aves igualmente puden padecer efermedades  cuyos agentes causales pueden llegar a través del alimento o del agua. Es por eso que son importantes los  análisis microbiológicos tanto del agua como de los aliementos. Los animales, no solamente las aves, podrían volverse intermediarios en la cadena de transmisión de agentes patógenos al hombre, cuando no existen los controles suficientes en el proceso de producción.
Escherchia coli O157:H7 o Escherichia coli  O157 no móvil pertenecen al grupo de Escherichia coli enterohemorrágicas, sin ser esta la única varidad serológica que integra el grupo.

Otras serovariedades enterohemorrágicas de Escherichia coli que  han afectado varios países son las siguientes:  O26:H11; O111:H8; O103:H2; O113:H21; O104: H21


Imagen No. 5. Una de las bacterias más frecuentes y perjudiciales para la industria avícola es la Escherichia coli. Los análisis microbiológicos de agua, materia prima y producto terminado, permiten establecer puntos de control en la cadena productiva; se trata en primera instancia de proteger la salud de las aves.
Los siguientes  son los géneros que integran el grupo coliformes:

  • Escherichia
  • Klebsiella
  • Enterobacter
  • Citrobacter
No todos los autores incluyen al género Citrobacter dentro del grupo de los coliformes.

Como no todos los coliformes son de origen fecal, los reportes de los análisis microbiológicos de alimentos reportan:

  • Coliformes totales (Comprende la totalidad delgrupo)
  • Coliformes fecales (Aquellos de origen intestinal)
Debido a la imposibilidad de diferenciar en forma estricta la Escherichia coli de origen fecal de otras Escherichia coli (De origen no fecal), existe la tendencia a  realizar y reportar en los exámenes de laboratorio a los  coliformes así:

  • Coliformes totales
  • Escherichia coli

El uso de la identificación de coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:

  • La detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y fabricación de alimentos.
  • La evaluación de la calidad microbiológica de un producto (Su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario cuando los coliformes son (Supuestamente) de origen no fecal).
  • Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas en un equipo.
  • La calidad sanitaria del hielo y distintos tipos de agua utilizados en las diferentes áreas de  procesamiento de alimentos.


Imagen No. 6  Los controles sanitarios  de los operarios incluyen hisopados de manos. Los reportes de  los análisis microbiológicos indican el estado sanitario de las manos, pero encontrar  en los cultivos Escherichia coli, no indica que necesariamente sea de origen fecal. En sentido estricto, no hay como determinar esto.

Si se revisa el tema de  la presencia de Escherichia coli en el agua, uno se ecuentra con el siguiente dato: "Da un alto grado de certeza, alrededor de 99%, de contaminación de origen fecal" (?). Mi pregunta es: como llegó a determinarse esta afirmación?

Considero que la certeza no es absoluta porque se han aislado cepas de Escherichia  coli que no tienen origen fecal.  Revisado el tema, no es posible diferenciar si la contaminación detectada en un análisis microbiológico,  realmente proviene de materia fecal de humanos y/o animales.


Tabla No. 1.  Los controles microbiológicos se deben  realizar  en diferentes puntos de la cadena de producción, en este caso del pollo de engorde. Las técnicas  pueden variar de una empresa a otra según se rijen por los códigos sanitarios de las entidades que controlan o vigilan la calidad sanitaria de los alimentos en cada país.

Existen metodologías  convencionales de laboratorio para detectar la presencia de coliformes, bien sea en medios líquidos o sólidos; estas tecnologías que implican entre otras cosas la utilización de campanas Durham para detectar la presencia de gas, han sido reemplazadas por la metodología enzimática de cromógeno-fluorógeno simultáneo, a la que me referiré más adelante.

Una forma de detectar la presencia de bacterias coliformes es emplear un medio que tenga bilis. Las bacterias  coliformes resisten   la presencia de bilis en el medio. Las demás bacterias no.

Además, se pude agregar al medio de crecimiento de las bacterias, un indicador de pH (Rojo neutro) que permita identificar la presencia de ácido debido a la fermentación de la lactosa.  Cuando la lactosa del medio es fermentada por las bacterias que crecen en él,  viran el medio (Que tiene el indicador de pH): como resultado las colonias se ven de color rojo. Igualmente precipitan las sales biliares  contenidas en el medio por lo cual se produce un halo claro color rosa alrededor de las colonias  rojas.

Para el recuento de colonias en placa se usa el agar-lactosa-bilis-rojo violeta (ABRV)


Un método para diferenciar los coliformes totales de la Escherichia coli en condiciones de laboratorio, se basa  en la presencia de betaglucoronidasa y/o beta-galactosidasa así:  Escherichia coli tiene betaglucoronidasa y betagalactosidasa; los demás coliformes tienen solo  beta-galactosidasa; otros microorgnismos pueden tener betaglucoronidasa pero no tienen betagalactosidasa. El funcionamiento se explica en el siguiente cuadro:

Tabla No. 2. Fundamentos usados en algunos laboratorios para diferenciar  coliformes de Escherichia coli como tal y de otros microorganismos.

El recuento de coliformes totales  se hace mediante una técnica denominada número más probable, que es una metodología "cuantitativa"; es un cálculo probabilístico aplicado a una serie de diluciones de inóculos en tubos (Mínimo tres tubos por cada  muestra) que contienen un medio de cultivo que es capaz de cambiar según tenga coliformes o no (se basa en que los coliformes totales fermentan la lactosa, por lo tanto producen ácido y gas cuando se incuban a 35ºC más o menos 1ºC, durante 48 horas, utilizando un medio de cultivo que tenga sales biliares).

Los tubos que recibieron una o más células de bacterias coliformes procedentes de una muestra, cambiarán cualitativamente, mientras que los que no recibieron ninguna célula microbiana coliforme, no tendrán cambios. Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en que algunos tubos contendrán solo un microorganismo y otros tubos no contendrán ninguno. Se aplica un cálculo probabilistico (Calcular la probabilidad de que los tubos no hayan recibido ninguna célula), se puede estimar el número más probale de microorganismos presentes en la muestra original.

La técnica "número más probable" tiene dos fases: una presuntiva y una confirmatoria.

Para la fase presuntiva se usa el caldo lauril-sulfato de sodio (Permite la recuperación de microorganismos que se encuentran en la muestra y que son capaces de utilizar la lactosa como fuente de carbono). En este medio se inhibe la flora Gram +. Para la prueba, se utilizan los tubos que producen gas bajo las anteriores condiciones.

Para la fase confirmatoria se utilizan los tubos en los que es evidente la producción de gas. De estos tubos se toman muestras que se inoculan en tubos que tienen  caldo lactosa-bilis-verde brillane. En este caldo solo crecen los microorganismos que son  capaces de tolerar las sales biliares y el verde brillante o sea los coliformes totales; esto se evidencia por la producción de gas en los tubos donde se cultivan las muestras.

La búsqueda de  Escherichia coli se hace a partir de los tubos positivos (que producen gas), mediante dos métodos: 

1) Sembrando en memdios sólidos: Agar MacConkey, agar EMB (Eosina-azu de metileno) o realizando la prueba IMViC  (Indol-metilo-Voges Proscauer-citrato) a partir de colonias típicas.
2) Sembrando en medio líquido utilizando el caldo EC-MUG (4-metil-ubeliferil-b-D-glucorónido). Esta técnica se basa en que  alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli (Incluyendo cepas no productoras de gas), producen la  enzima beta-glucoronidasa, la cual actúa sobre el  4-metil-umbeliferil-b-D-glucorónido o MUG para generar  4-metilumbeliferona o MU. la cual al exponerla a la luz  ultravileta de longitud de onda larga (365 nm), produce una fluorescencia azul.

La formación de gas e indol se hace en los mismos tubos positivos para fluorescencia para Echerichia coli, se confirma la produción de gas (debida a la fermentación de la lactosa) mediante tubos Durham; igualmentese confirma la producción de indol agregando reactivo de Kovacs al tubo, una coloración rojo cereza es positivo.

Esta metodología tiene  inconvenientes, entre otras cosas porque hay cepas de Escherichia coli que no producen gas.

Para obviar esto, se puede hacer la búsqueda simultanea de coliformes totales y de Escherichia coli mediante el método cromógeno-fluorógeno simultáneo. La técnica se fundamenta en que en un medio líquido en el cual se inhibe el crecimiento de la flora  Gram +, se inocula  la muestra a analizar, y si la muestra contiene coliformes totales, la actividad de la beta-galactosidasa se evidencia mediante la adición de dos sustratos crómógenos:

1) X-GAL:  5-bromo-4-cloro-3-indol-beta-D-galactopiranósido
2)IPTG: 1-isopropil-beta-D-1-galactopiranósido

Interpretación:  es psositivo cuando desarrolla color verde azulado del medio líquido.

Si la muestra contiene Escherichia coli, la actividad beta-D-glucoronidasa se evidencia mediante el desdoblamiento del fluorógeno MUG (4-metil-unbeliferil-bet-D-glucorónido) generandose  4-metil-umbeliferona o MU el cual es fluorescente cuando se expone a luz ultravileta de longitud de onda larga (36 nm). Interpretación: positivo si hay fluorescencia.


Imagen No. 8:  Método de cromógeno-fluorógeno simultáneo para detectar la presencia de colifores totales y Escherichia coli al tiempo. El color verde azulado de los tubos en la fotografía de la izquierda indica que hay crecimientode coliformes totales. Los tubos del centro y de la derecha donde  hay fluorescencia (Señalados con las flechas) hay crecimientode Escherichia coli.



Tabla  No. 2   Idntificación de Eschericia coli mediante pruebas bioqímicas convencionales.




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